Escribir este libro también es como un experimento de cocción lenta

Experimentos de cocción lenta como receta para entender impactos del cambio global

En las selvas húmedas de Centro y Sur América, unos escarabajos pequeños pasan su vida escondidos en los tubos que forman las hojas jóvenes de varias plantas emparentadas con el banano, el jengibre y los platanillos. Allí nacen, se alimentan de las hojas tiernas, crecen, se reproducen y mueren. Sus vidas parecen simples, pero estudiarlas ha brindado una perspectiva inusual sobre cómo responderían las especies tropicales al cambio climático, quizás la principal amenaza que enfrentamos los seres vivos en este planeta. Esa comprensión ha sido posible gracias a lo que Carlos García-Robledo, quien lleva más de dos décadas estudiando estos insectos, sus interacciones con las plantas y sus respuestas a cambios en el ambiente, denomina “experimentos de cocción lenta”.

Un día cualquiera, cuando Carlos era estudiante de biología en la Universidad de los Andes, a donde llegó gracias a una beca en la década de 1990, recibió una invitación a almorzar. La profesora Bette Loiselle, una gran figura de la biología tropical, visitaba Bogotá y la universidad, y se había organizado un encuentro con estudiantes para conocerla. Carlos recuerda que, mientras comían sandwiches con Bette, varios de sus compañeros, tímidos, se presentaron brevemente, pero él se lanzó a hablar. No tuvo que recurrir a su terrible inglés de entonces, pues Bette hablaba español. Describió sus intereses refiriéndose a preguntas de investigación, a hipótesis, a predicciones.

La pasión con la que Carlos hablaba de sus ideas no pasó desapercibida para Bette. Al poco tiempo, le propuso vincularse a una investigación que desarrollaba con dos colegas colombianos, Carolina Murcia y Gustavo Kattan, en bosques de la Cordillera Central. Semanas después, Carlos comenzó su trayectoria como biólogo de campo en el Parque Ucumarí y el Santuario de Fauna y Flora Otún Quimbaya, en el departamento de Risaralda. Allí dio sus primeros pasos trabajando en interacciones ecológicas entre insectos y plantas con Carolina y Gustavo. También iniciándome en lides similares con los mismos mentores, yo tuve la fortuna de compartir esos primeros días —y muchos más a lo largo de los años— con él en el monte.

Tiempo después, cuando ya había completado un estudio sobre el impacto de los insectos herbívoros de esos bosques sobre plantas silvestres de la familia del café, Carlos tuvo una epifanía. Gracias a la libertad para explorar que le daban sus largas temporadas en el campo, conoció una planta de la familia de los anturios con un comportamiento atípico. En lugar de abrir sus flores durante el día, lo hacía de noche. Al caer la tarde, las flores emitían un aroma dulce y, además, se calentaban, atrayendo escarabajos. Una vez los insectos llegaban a las flores tibias para alimentarse de su néctar, éstas se cerraban, dejándolos atrapados hasta la noche siguiente. Cuando por fin volvían a abrirse, los escarabajos salían, cubiertos de polen, que luego dejarían en flores de otras plantas, contribuyendo así a su reproducción.

Carlos determinó que, entre más visitas recibieran las plantas por parte de dos especies de escarabajos, mayor resultaba su producción de frutos y semillas. Observó, además, que una tercera especie también era un polinizador significativo, pero jugaba a dos bandas: ponía sus huevos en las plantas, de modo que sus larvas devoraban una cantidad nada despreciable de los frutos. El bicho era, a la vez, un mutualista y un enemigo natural de las plantas.

Fascinado, Carlos se sumergió en el estudio de ese sistema de interacción entre plantas e insectos. Se maravilló. Dejó volar su curiosidad naturalista por conocer más, por observar y seguir observando. Disfrutó como un niño midiendo la temperatura de flores durante noches enteras usando un termómetro diseñado para medir la temperatura de la cloaca de pájaros. También empezó a vislumbrar oportunidades.

En ciencias, suele pensarse que los estudios más rigurosos son aquellos que incluyen experimentos, en los que los investigadores ponen a prueba hipótesis mediante la manipulación de variables que permitan verificar si sus predicciones se cumplen. Carlos comprendió que los sistemas de interacción entre plantas e insectos, como los de esa especie que luego supimos que se llamaba Xanthosoma daguense, se prestaban para hacer manipulaciones. Y descubrió que la combinación de exploración y manipulación era lo que realmente le apasionaba.

Él podía cambiar la cantidad de flores en una planta y ver su efecto sobre la polinización y depredación de semillas. Podía marcar escarabajos, recapturarlos días más tarde y conocer qué tanto polen transportaban y cómo se movían entre plantas. Empezó a soñar con hacer diversos estudios de ecología experimental con insectos y plantas. En el campo. Entendió que las interacciones entre plantas e insectos ofrecían la posibilidad de experimentar directamente con procesos ecológicos —y hasta evolutivos— en acción.

Cuando Carlos quiso contarle sobre sus descubrimientos e ideas a la profesora Carol Horvitz, de la Universidad de Miami, se puso tan nervioso que terminó derramándose un café encima. Pero aquel primer encuentro no debió ser tan desastroso, pues por invitación de Horvitz, muy pronto estaría haciendo su primera visita a la Estación Biológica La Selva, un lugar icónico para los estudios tropicales en Costa Rica. Allí se encontraría con los escarabajos del género Cephaloleia que viven en las hojas enrolladas de las plantas zingiberales del bosque tropical, empezando una aventura que hoy continúa.

Avancemos a la década de 2020. Carlos terminó sus estudios doctorales bajo la tutoría de Horvitz en Miami hace varios años y, tras hacer un postdoctorado en el Museo Smithsonian de Historia Natural en Washington, y trabajado un tiempo como investigador del Instituto de Ecología en Xalapa, México, hoy es profesor asociado en el Departamento de Ecología y Biología Evolutiva de la Universidad de Connecticut, Estados Unidos. Allí dirige el Laboratorio de Interacciones Bióticas y Cambio Global, un grupo de investigación que estudia las consecuencias ecológicas y evolutivas de los cambios en el ambiente en las interacciones entre plantas y artrópodos combinando experimentos hechos en el laboratorio y el campo —en sitios extaordinarios en Costa Rica, Colombia y México— con análisis de demografía, genética, biología molecular y fisiología.

«La gente lee mis estudios de demografía y se duerme. Son puras ecuaciones, qué pereza», me dijo Carlos hace unos días. Y tenía razón: parte de lo que escribe es árido y difícil de digerir para los no expertos. Pero esa base matemática es fundamental en su agenda de investigación.

Al hablar de otros de sus escritos, se entusiasma más. Hace poco, él y sus colegas descubrieron que Cephaloleia belti, un escarabajo del volcán Barva en Costa Rica, presenta dos variantes genéticas: una predominante en zonas bajas y cálidas, y otra en zonas altas más frescas. Demostraron que cada variante está bien ajustada a su propio rango de temperaturas pero que, si la temperatura sube más de 2°C, tanto los escarabajos con genes de clima frío como aquellos con genes de clima cálido enfrentarían dificultades en las zonas más bajas, lo que podría llevar a la reducción de sus poblaciones o incluso a su extinción local. Sin embargo, las zonas más altas servirían como refugio, permitiendo su persistencia a pesar del calentamiento.

¿Cómo supieron todo eso? Con experimentos de cocción lenta. Estudios que, como muchas preparaciones culinarias que requieren tiempo y cuidado, demandan paciencia y método. Carlos, además, le ha agregado ingredientes a la receta: inventiva, intuición, rigor, tecnología. La inspiración para hacer esos experimentos, que han sido un caballito de batalla de su carrera investigativa, vino de su lectura de un artículo de 1948.

Louis Charles Birch fue un genetista australiano conocido por sus estudios en ecología de poblaciones. Con el interés de entender cuáles serían las mejores condiciones ambientales para preservar granos almacenados en Australia durante la Segunda Guerra Mundial, Birch estudió la influencia de la temperatura y la humedad sobre la supervivencia y la reproducción de un gorgojo llamado Calandra oryzae. Buscaba saber cuáles serían las condiciones menos favorables para la proliferación de estos insectos, que son plagas de los granos almacenados. Para sus análisis, Birch se basó en el trabajo de un matemático especialista en demografía humana, Alfred Lotka, quien siendo empleado por una compañía de seguros en Nueva York, introdujo en sus trabajos de actuaría el concepto de tasa intrínseca de crecimiento poblacional. Lotka demostró que, conociendo datos de fecundidad y mortalidad de individuos de diferentes edades en una población de personas, era posible calcular su tasa exponencial de crecimiento. En otras palabras, explicó cómo saber si, dadas las tasas de natalidad y mortalidad de individuos de distintas edades, una población expuesta a unas condiciones ambientales particulares tendería a aumentar o a decrecer, y a qué velocidad. Conociendo el trabajo de Lotka, Birch empleó los datos de nacimientos y muertes de C. oryzae que había recopilado para calcular, por primera vez, la tasa intrínseca de crecimiento de una población de insectos.

Con su introducción del concepto de tasa intrínseca de crecimiento poblacional en la ecología y la genética, Birch desarrolló una herramienta clave para medir lo que los biólogos evolutivos llamamos aptitud, adecuación, o fitness — el éxito reproductivo de los organismos en comparación con otros de su misma especie en un ambiente determinado. Gracias a su trabajo, contamos con el arsenal metodológico y matemático para abordar preguntas cómo qué tan bien adaptados están los individuos de una población a condiciones particulares y cuál sería su potencial para persistir y adaptarse frente a condiciones cambiantes.

Carlos me contó que leer el artículo clásico de Birch cambió su vida, pero aclaró que él, en realidad, nunca tuvo información suficiente para calcular el fitness de los gorgojos. Su trabajo fue más una demostración de los métodos para estimar las tasas de crecimiento poblacional de insectos en el laboratorio que una descripción precisa de éstas. Las primeras estimaciones de dichas tasas para insectos de ecosistemas tropicales solo aparecieron cuando Carlos desarrolló su programa de investigación con los escarabajos que se alimentan de plantas zingiberales en Costa Rica. Él publicó su primer artículo sobre el tema en Journal of Animal Ecology, la misma revista británica donde Birch publicó el suyo en 1948. Pero una cosa es estudiar gorgojos que viven por unas pocas semanas en graneros australianos y otra trabajar con especies que pueden vivir años en las selvas centroamericanas.

En su primera visita a La Selva, superado el episodio del café con Carol Horvitz, Carlos empezó a conocer a los escarabajos que viven y se alimentan en las hojas de las zingiberales en la estación. Empezó por observarlos. Contrario a lo que algunos investigadores habían señalado, notó que en La Selva no había pocas especies de estos escarabajos y que no todas se comportaban igual. En cambio, allí había muchas especies. Unas tenían dietas especializadas en una sola planta mientras que otras eran generalistas, capaces de comer hojas de muchas plantas. Algunos escarabajos incluso comían hojas de especies exóticas de origen asiático, que hacía poco habían sido introducidas en la reserva.

Allí reconoció una mina de oro en potencia para desarrollar sus intereses de investigación, pero entendió que tenía que comenzar por lo básico. Su trabajo arrancó desde la historia natural y la taxonomía. Comprendió primero cuáles son las especies de escarabajos, cómo se pueden reconocer a partir de su apariencia física, dónde se encuentran, de qué especies de plantas se alimentan. Luego aprendió de genética, lo que le permitió delimitar mejor las especies comparando sus secuencias de ADN. Más adelante, usó análisis de biología molecular para estudiar con precisión la dieta de diferentes escarabajos, analizando el ADN vegetal encontrado en sus estómagos para identificar las plantas que comían.

Tras conocer la historia natural de algunas especies de escarabajos, llegó el momento de experimentar con ellas. La idea de que muchos insectos tropicales están altamente especializados para alimentarse de plantas específicas ha sido ampliamente aceptada, en parte gracias a estudios como los de Paul Ehrlich y Peter Raven, quienes vincularon dicha especialización a procesos de evolución recíproca entre insectos y plantas. Sin embargo, a Carlos le intrigaba el caso de algunos escarabajos de La Selva, cuyas dietas eran curiosamente amplias. Le interesaba su capacidad para alimentarse de hojas de plantas asiáticas, con las que no habían tenido una larga historia de coevolución. ¿Se habrían adaptado recientemente a estas plantas exóticas mediante selección natural, o tenían características preexistentes que les permitían ampliar su dieta con facilidad?

Para contestar esta pregunta, Carlos ideó uno de sus primeros experimentos inspirados en los métodos de Birch. Tendría que establecer colonias de escarabajos en cautiverio, ponerlos a comer hojas de sus plantas nativas preferidas y de las especies exóticas, lograr que se ajustaran a ese entorno de forma que llegaran a reproducirse, y, finalmente, calcular las tasas intrínsecas de crecimiento poblacional bajo diferentes dietas. Para ello, debería medir la supervivencia y fecundidad (el número de crías producidas) de números grandes de escarabajos de diferentes especies (unas especialistas dietarias, otras generalistas), en distintos estadíos de desarrollo y edades (huevos, larvas, juveniles y adultos), a lo largo de toda su vida, hasta que murieran. Y repetir todo esto varias veces, alimentando a los insectos con distintas plantas. Si las poblaciones experimentaran tasas de crecimiento negativas al exponerse a las dietas que no conocían, concluiría que, para poder alimentarse de nuevas plantas, tendrían que pasar por un proceso de selección natural. En cambio, si las poblaciones experimentaran tasas de crecimiento positivas, los escarabajos podrían persistir con dietas novedosas, implicando que estarían preadaptados para cambiar de fuente de alimento.

Los resultados respaldaron la segunda hipótesis: algunos escarabajos costarricenses tienen suficiente plasticidad para alimentarse de plantas asiáticas y mantener poblaciones viables sin necesidad de adaptarse. Pero más que la respuesta, lo admirable es la manera en que Carlos abordó la pregunta. Para llegar a sus conclusiones, estableció un laboratorio en pleno campo para medir el fitness de los organismos, la moneda de cambio de la evolución. Esto no fue trivial, pues los escarabajos que estudió pueden vivir hasta dos años, pasando hasta seis meses en su fase larval. Recolectar cada dato tomó años, tiempo en el que no solo tuvo que mantener a los animales sino también a un equipo de técnicos capacitados para alimentarlos con plantas del bosque y cuidarlos prácticamente uno a uno, bajo condiciones estrictamente controladas.

Hoy, más de 15 años después de su creación, el laboratorio de campo de Carlos sigue activo. Su carrera ha sido un diálogo constante entre la observación de la naturaleza y la experimentación: la historia natural sigue inspirándolo para formular preguntas e interpretar resultados. Tras perfeccionar los métodos para medir fitness en distintos contextos, continúa explorando cuántas y cuáles especies de escarabajos existen y con qué plantas interactúan. Descubrió que, contrario a lo que sugería la clasificación tradicional basada en su apariencia externa, en las montañas de Costa Rica no hay especies de escarabajos de distribución amplia y gran plasticidad en su tolerancia a distintas temperaturas, lo que les permitiría resisitir al cambio climático. En cambio, allí habitan especies crípticas, imposibles de distinguir a simple vista pero detectables con datos de ADN. Esas especies ocupan rangos de elevación estrechos y tienen poca tolerancia a variaciones de temperatura. Sus experimentos demostraron que cada una está bien adaptada a las condiciones térmicas de su elevación y enfrentaría serias dificultades para persistir allí si el clima cambiara.

Ahora Carlos quiere entender en mayor detalle cómo el aumento de la temperatura que experimenta el planeta afecta la supervivencia, la longevidad y la reproducción de sus escarabajos. Quiere hacerlo en el campo, pues piensa que los efectos del calentamiento global no solo dependen de la tolerancia fisiológica de cada especie, sino también de las relaciones ecológicas que mantienen con otras. Por un lado, su investigación actual busca determinar si los escarabajos generalistas son más resistentes al aumento de temperatura que los especialistas y si, como consecuencia, las comunidades de insectos estarán dominadas en el futuro por especies con hábitos más amplios. Por otra parte, él ha visto que las plantas de las que se alimentan estos insectos tienen alianzas con hormigas depredadoras que las protegen a cambio de refugio, y por eso quiere saber si el calentamiento modificará las interacciones entre depredadores y presas, ya sea generando un espacio libre de enemigos para los herbívoros o desencadenando efectos en cascada en la red trófica. Para abordar este asunto, Carlos está sacando lo que aprendió en su laboratorio de las instalaciones de La Selva al propio bosque.

En lugar de criar escarabajos en cajas de plástico en el laboratorio, donde él y su equipo podían controlar la temperatura fácilmente y alimentarlos con pedacitos de hojas, ahora están calentando plantas enteras en el bosque y monitoreando el impacto de la temperatura sobre las poblaciones. Su experimento en curso es ambicioso no solo en el método sino también en su alcance: estudia tanto escarabajos generalistas como especialistas, no solo midiendo sus tasas vitales, como ha hecho durante años, sino también cuantificando la depredación que sufren en diferentes etapas de su ciclo de vida a manos de las hormigas. Además, analiza cómo esa interacción, bajo diferentes temperaturas, influye en la dinámica de las poblaciones. En últimas, podrá determinar si los efectos del cambio de temperatura sobre los escarabajos serán directos o si estarán mediados por sus interacciones ecológicas.

Reflexionando sobre qué hemos aprendido a partir de su trabajo de varios años, Carlos señala que la conservación de especies en un entorno de clima cambiante se favorecería si pensáramos en conservar una variedad de poblaciones de cada una. Así preservaríamos su diversidad genética resultado de procesos de adaptación local, y con ella su capacidad de responder a cambios en el ambiente. Está orgulloso no solo de las preguntas que ha logrado responder, sino de lo que ha logrado construir y mantener: un laboratorio único para estudiar el impacto del cambio ambiental global en el trópico.

Pero él no se conforma con lo que ha aprendido sobre los escarabajos de las zingiberales, ni con sus desarrollos experimentales. «Siempre hago cosas alternas, me la paso buscando otros sistemas», señaló emocionado mientras me contaba sobre unos animales minúsculos que ha venido investigando.

Se trata de un conjunto de especies de ácaros, parientes de las arañas y las garrapatas, que se alimentan del néctar de las flores en las selvas tropicales y viajan de flor en flor escondidos en el pico de los colibríes. Los estudios clásicos sobre la historia natural de la interacción entre ácaros, flores y colibríes reportaron que los ácaros son áltamente especializados en las plantas que visitan, e incluso sostuvieron que cada especie de planta es colonizada regularmente sólo por una especie de ácaro. Según estas investigaciones, la especialización se explicaría porque aferrarse a una planta hospedera particular incrementaría la probabilidad de los ácaros de encontrar parejas: además de proveer alimento, las flores servirían como punto de encuentro para la reproducción. Influenciado por su experiencia estudiando las interacciones poco especializadas entre muchos escarabajos y las plantas, a Carlos le pareció extraño que en los ácaros existiera un grado de especialización tan extremo.

Tal como lo hizo para los escarabajos de las zingiberales, se dio a la tarea de revisar los supuestos sobre la historia natural del sistema, empezando por la forma en que se reconocen las especies de ácaros. A las identificaciones basadas en morfología, les sumó datos de secuencias de ADN. Los resultados confirmaron su corazonada: la mayoría de especies de ácaros no son especialistas en una planta, sino generalistas. Además, es frecuente encontrar múltiples especies coexistiendo en la misma flor. Así, descubrió que todo un cuerpo teórico sobre las razones de la especialización en los ácaros y sus consecuencias evolutivas —incluido su posible papel en la formación de nuevas especies— se basaba en escritos de historia natural plagados de errores. Sus hallazgos pisaron callos, pero así funciona la ciencia.

Carlos también se intrigó por cómo los ácaros detectan a los colibríes, su veloz medio de transporte, siendo casi ciegos. Algunos estudios sugerían que usaban el olfato, pero la evidencia experimental le parecía débil. Él mismo ofreció estímulos olfatorios a los ácaros de los colibríes y no detectó respuesta. En cambio, encontró que otros ácaros, que no viajan en colibrí sino en escarabajos, sí usan el olfato para reconocer sus especies favoritas para transportarse. Los ácaros de los colibríes debían emplear alguna otra forma para detectarlos.

Los ácaros de las flores no pueden saltar, de manera que otra incógnita era cómo logran subirse a los picos de los colibríes. Carlos recordó un estudio sobre garrapatas que “vuelan” hacia sus hospedadores, atraídas por la electricidad estática que los animales acumulan. Pensando en los colibríes como cuerpos eléctricamente cargados, se imaginó que explorando este asunto podría encontrar una respuesta.

Una de las ventajas de trabajar en estaciones biológicas como La Selva es la oportunidad para pensar en proyectos y generar ideas conversando pausadamente con una diversidad de investigadores con los que uno se encuentra. Durante un almuerzo en la estación, Carlos charlaba con su colaborador Diego Dierick sobre la posibilidad de que los ácaros detectaran a los colibríes reconociendo sus impulsos eléctricos y usaran la estática como el mecanismo para subirse a sus picos. Por pura casualidad, en el comedor también estaba Konstantine Manser, un estudiante del grupo de investigación que había publicado el artículo sobre garrapatas que había llamado la atención de Carlos, quien estaba buscando ideas para un proyecto.

Los tres se conectaron y conformaron un equipo. Lo que comenzó como una simple intuición pronto se convirtió en una serie de experimentos meticulosamente diseñados. Cada prueba confirmó que los ácaros respondían a los campos eléctricos, demostrando algo nunca antes visto en la naturaleza. En efecto, los ácaros tienen la habilidad de detectar campos eléctricos que producen los colibríes cuando baten sus alas empleando sensores que tienen en sus patas, y así se mueven hacia ellos. Luego, usan la electricidad estática para adherirse los picos de los colibríes. Reseñando su investigación, el periódico The New York Times destacó que representa el primer ejemplo del uso de electrorecepción por parte de animales en foresis, el término técnico que describe cuando un organismo se transporta sobre otro.

Conversando sobre su trabajo con los ácaros, le pedí a Carlos que me expresara su visión de la importancia de la observación de la naturaleza y la ciencia fundamental, esa que no siempre tiene tener un valor práctico inmediato ni conduce al desarrollo de tecnología o a la solución de problemas concretos. Me habló sobre la curiosidad como un motor esencial para atraer a más personas a la ciencia. Señaló que, a diferencia de lo que sucede con sus papers experimentales que dan sueño, sus relatos sobre historia natural producen asombro.

Las personas se conectan con cosas sencillas, como saber que hay unos animalitos que viajan de flor en flor trepándose en colibríes cargados eléctricamente. Además, me explicó que esos diminutos pasajeros pueden ser esenciales para repartir la energía en los bosques, consumiendo hasta la mitad del néctar que producen las flores de las que se alimentan. Coincidimos con él en que pensar en el papel de esos bichitos —pequeñas cosas que dominan el mundo, como diría el naturalista E. O. Wilson— no solo maravilla. También genera una profunda sensación de humildad.

Mientras hablábamos de lo fascinante que resulta para cualquier persona conocer sobre la historia natural de los ácaros, Carlos cambió de tema. «Bueno, además de todo, ese sistema de los ácaros es manipulable», me dijo. «Usted podría hacer un montón de experimentos. Se puede echarles permatrina y eliminar a toda una colonia, se puede infectar una flor para calcular cuánto néctar se están comiendo, se puede calentar las colonias y ver cómo crecen». Está pensando en que, si logra criar ácaros en el laboratorio, como solo comen azúcar y tienen ciclos de vida cortos, podría hacer muchos más experimentos y avanzar rápido contestando preguntas.

Más de un cuarto de siglo después del encuentro con Bette Loiselle que trazó su camino, Carlos sigue transitando entre su fascinación por los organismos y su interés en usarlos como modelos para poner a prueba hipótesis y contribuir a construir mejores teorías. Su pasión por conocer más sobre historia natural y hacer mejores experimentos no solo ha cambiado lo que sabemos sobre insectos y sus interacciones, sino que sigue iluminando preguntas más grandes sobre cómo la biodiversidad se enfrenta al cambio global.

El investigador recomienda

García‐Robledo, C., et al. (2005). Equal and Opposite Effects of Floral Offer and Spatial Distribution on Fruit Production and Predispersal Seed Predation in Xanthosoma daguense (Araceae). Biotropica. 37(3), 373-380.

García‐Robledo, C., & Horvitz, C. C. (2011). Experimental demography and the vital rates of generalist and specialist insect herbivores on native and novel host plants. Journal of Animal Ecology, 80(5), 976-989.

García-Robledo, C., Erickson, D. L., Staines, C. L., Erwin, T. L., & Kress, W. J. (2013). Tropical plant–herbivore networks: reconstructing species interactions using DNA barcodes. PLoS One, 8(1), e52967.

García-Robledo, C. et al. (2016). Limited tolerance by insects to high temperatures across tropical elevational gradients and the implications of global warming for extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences, 113(3), 680-685.